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李曉川 孔軼群　冷凱良　王聯(lián)珠　李兆新　林　洪

摘    要

    氯霉素由于存在嚴(yán)重毒副作用，已被許多國家和地區(qū)列為禁用藥物。水產(chǎn)品中氯霉素殘留檢測方法的檢出限已成為國際貿(mào)易合作中新的技術(shù)性壁壘。本文分析比較了幾種常用氯霉素殘留的檢測方法，并對其特點及檢出限進(jìn)行了概括性敘述。

    Analysis of determination methods of chloramphenicol residues in aquatic products

    氯霉素（Chloramphenicol，CAP），是一種有效的廣譜抗生素，常用于動物各種傳染性疾病的治療，對多種病原菌有較強的抑制作用，曾在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中得到廣泛應(yīng)用，同時也帶來了水產(chǎn)品中氯霉素殘留的嚴(yán)重問題。氯霉素存在嚴(yán)重的毒副作用，能抑制人體骨髓造血功能，引起人類的再生障礙性貧血、粒狀白細(xì)胞缺乏癥、新生兒、早產(chǎn)兒灰色綜合癥等疾病，低濃度的藥物殘留還會誘發(fā)致病菌的耐藥性，因此動物食品中的氯霉素殘留對人類的健康構(gòu)成了巨大威脅（蔣定國 2002；胡頂飛 2001）。

    氯霉素殘留問題已引起國際組織和世界上許多國家和地區(qū)的高度重視。歐盟、美國等均在法規(guī)中規(guī)定CAP殘留限量標(biāo)準(zhǔn)為“零容許量”（Zero tolerance）（Georage　2002），即不得檢出。我國是一個水產(chǎn)養(yǎng)殖大國，養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴大，但養(yǎng)殖過程中濫用抗生素，已成為一個嚴(yán)重的水產(chǎn)品安全問題。自去年以來，我國出口水產(chǎn)品頻頻被進(jìn)口國檢出氯霉素殘留。去年9月底，歐盟因氯霉素殘留問題將中國產(chǎn)凍蝦產(chǎn)品納入其食品快速預(yù)警機制，又于今年初通過決議，自2月1日起全面暫停從中國進(jìn)口動物制品；2002年1月，美國FDA也對我國蝦產(chǎn)品發(fā)出預(yù)警通報；3月中旬，日本厚生省宣布對我國動物產(chǎn)品實施嚴(yán)格檢查，并公布了包括氯霉素在內(nèi)的11種藥物的殘留限量。今年1到6月，我國水產(chǎn)品對歐盟出口量、出口額比去年同期分別下降70.8%和73%。藥物殘留已成為擴大水產(chǎn)品國際貿(mào)易的主要障礙。針對這種情況，農(nóng)業(yè)部已將氯霉素從2000年《中國獸藥典》中刪除，此藥重新進(jìn)入安全評價體系，在《動物性食品獸藥殘留規(guī)定》中規(guī)定可食部分不得檢出，并且在出口的日常檢測中，將其列為必檢項目，一旦發(fā)現(xiàn)超標(biāo)，一律禁止出口。

    對于氯霉素殘留，由于存在多種檢測方法，因此各種方法的檢出限問題已成為關(guān)注的焦點。發(fā)達(dá)國家對檢出限的要求越來越嚴(yán)格。歐盟由原來的10 μg/kg改為1 μg/kg，繼而又降至0.1 μg/kg，比原標(biāo)準(zhǔn)要求提高了100倍；美國FDA規(guī)定的檢出限也由原來的5 μg/kg改為1 μg/kg，即將降為0.3 μg/kg，且目前正在研究應(yīng)用更為靈敏的方法，可使檢出限值達(dá)0.1 μg/kg。水產(chǎn)品中氯霉素殘留檢測方法的檢出限已在國際貿(mào)易合作中成為新的技術(shù)性壁壘。

    為保障食用者的健康，應(yīng)對技術(shù)壁壘，在全球性貿(mào)易競爭中立于不敗之地，必須加強水產(chǎn)品中的藥物殘留監(jiān)控檢測工作，氯霉素即為其中的熱點之一。近年來各種關(guān)于氯霉素殘留的檢測方法不斷涌現(xiàn)，大致可分為三大類：第一類是生物測定法，第二類是化學(xué)分析法，第三類是兼有生物和化學(xué)的酶聯(lián)免疫檢測法。

    本文結(jié)合國內(nèi)外的報道，對幾種常用的氯霉素殘留檢測方法做了概括性敘述，并對其特點及檢出限進(jìn)行了分析比較。

1　篩選檢驗方法

    在實際工作中，不可能也無必要對所有動物性水產(chǎn)品進(jìn)行各種復(fù)雜、昂貴耗時的分析檢測，為能快速確定動物食品中是否有氯霉素殘留，通常做法是遵循一定程序，對被測產(chǎn)品進(jìn)行取樣，按規(guī)范要求對樣品進(jìn)行篩選檢驗（Screening method），對篩選為陽性的樣品再用更精確的方法進(jìn)行定量鑒定。

1.1　微生物法

    在快速篩選檢驗程序中，微生物法非常有效，這類方法簡單、費用少、速度快，因而廣泛用于動物性食品獸藥殘留的初篩。

1.1.1　棉簽法

    棉簽法（Swab test on premises，STOP），又稱現(xiàn)場拭子法，是檢測動物體中抗生素殘留的現(xiàn)場試驗方法。本法自1979年由美國農(nóng)業(yè)部食品安全和檢驗署研究開發(fā)出以后，世界各國都普遍采用，目前在加拿大和美國，試劑已商品化，有藥盒形式的商品出售（李誠 1993）。

    該方法是用棉簽（拭子）采取動物體內(nèi)的組織液，然后將其放置于涂滿枯草桿菌的培養(yǎng)基中保溫過夜。觀察是否在拭子周圍出現(xiàn)抑菌環(huán)，若有，即表明組織液中有抗生素存在。如果該動物僅用氯霉素進(jìn)行過治療，則可以認(rèn)為該組織中存在氯霉素殘留。梅先之（1997）用該法對鯉魚體內(nèi)氯霉素殘留進(jìn)行了研究。 他采用枯草芽孢桿菌菌株配制芽孢懸浮液。將切碎魚肉與不同濃度氯霉素標(biāo)準(zhǔn)液混合，用上述方法檢測是否形成抑菌圈，結(jié)果表明檢出限為1.00 μg/g。

    此方法在幾分鐘內(nèi)即可完成取樣操作，16～18 h即可獲得結(jié)果，是簡便易行而又有一定準(zhǔn)確性的檢測方法，比較適合基層現(xiàn)場篩選檢測（宋華賓 1993）。但是該檢測法靈敏度較差，檢出限較高，多在μg/g級，特異性差，一般抗生素類藥物都有此類反應(yīng)，而且不能定量。

1.1.2　杯碟法

    樣品經(jīng)處理后，注入牛津杯中，與含菌液的檢定平板貼合，培養(yǎng)后，根據(jù)抑菌圈有無及大小判定結(jié)果。采用不同的試驗菌種，可檢測不同的抗生素（宋華賓 1993）。

    焦彥朝（2000）用此法研究了鯉魚體內(nèi)氯霉素殘留。向均勻切碎的魚肉中加入適量氯霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液（不含土霉素），37 ℃培養(yǎng)基平衡1 h，加入乙酸乙酯，勻漿后離心，取上清液，70 ℃減壓濃縮，濃縮物中加入含土霉素的磷酸緩沖液，渦旋振蕩后，45 ℃水浴放置30 min，過濾，濾液備用。用標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程計算氯霉素效價，與應(yīng)有效價相比，以超出50%的回收率為低端檢出限。另外，在樣品處理過程中分別加入青霉素、土霉素以消除干擾影響。研究表明，此法檢出限為0.25 μg/g；氯霉素濃度在0.25～1.00 μg/g時回收率范圍在66%～69.2%之間，平均回收率為67.5%；而且排除了青霉素、土霉素的干擾。

    這種方法與棉簽法相比，靈敏度高，能夠排除一定的干擾，但是，要進(jìn)一步提高靈敏度很困難。

1.1.3　其他方法

    其它微生物法還包括紙片法、瓊脂擴散法、TTC法、BBRT法等，這些方法都存在靈敏度低的缺點。

    微生物法易受組織中其它抗生素的影響，特異性低，靈敏度也不高，但操作簡便，樣品用量少，預(yù)處理簡單，在基層大規(guī)模篩選工作中有很大的應(yīng)用價值。

1.2　免疫分析方法（IA）

    免疫分析是以抗原與抗體的特異性、可逆性結(jié)合反應(yīng)為基礎(chǔ)的新型分析技術(shù)。免疫反應(yīng)具有很高的選擇性和靈敏性，因此，免疫分析技術(shù)無論作為獸藥殘留分析的檢測手段還是樣本凈化方法都能使分析過程特別是前處理步驟大大簡化。作為相對獨立的檢測方法，即基于競爭結(jié)合分析原理的免疫測定法，包括酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）、放射免疫測定法（RIA）、固相免疫傳感器等（謝愷舟 2001）。

    目前使用很普遍的酶聯(lián)免疫法（ELISA），具有操作簡便、靈敏度高、樣品容量大、儀器化程度和分析成本低的優(yōu)點，是目前較理想的殘留篩選性分析方法之一。

    ELISA是基于抗原和抗體反應(yīng)而建立的。由于氯霉素是半抗原，不能刺激機體產(chǎn)生抗體。要使半抗原性物質(zhì)具有免疫原性，就需使其與大分子載體物質(zhì)（蛋白質(zhì)）相結(jié)合制備人工抗原，而后將其作為抗原進(jìn)行使用，動物體內(nèi)即可產(chǎn)生相應(yīng)特異性的抗氯霉素的抗體。在此基礎(chǔ)上建立酶聯(lián)免疫競爭法測定氯霉素含量（劉智宏 1995）。

    以德國R-Biopharm公司制造的酶聯(lián)免疫分析定量檢測氯霉素殘留試劑盒為例，其微孔板包被有針對兔IgG（氯霉素抗體）的羊抗體。加入氯霉素抗體，氯霉素酶標(biāo)記物，氯霉素標(biāo)準(zhǔn)或樣品溶液。游離氯霉素與氯霉素酶標(biāo)記物競爭氯霉素抗體結(jié)合位點（競爭性酶免疫分析），同時氯霉素抗體也與固定的羊抗體結(jié)合。沒有結(jié)合的氯霉素酶標(biāo)記物在洗滌步驟中被除去。將酶基質(zhì)（過氧化脲）和發(fā)色劑（四甲基聯(lián)苯胺）加入到孔中并且孵育。結(jié)合的氯霉素酶標(biāo)記物將無色的發(fā)色劑轉(zhuǎn)化為藍(lán)色產(chǎn)物。加入反應(yīng)終止液后使顏色由藍(lán)轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色。在450 nm處測量。吸光度值與樣品中的氯霉素濃度成反比。在對蝦或魚肉樣品的檢測中，此種方法靈敏度高，檢測下限可達(dá)0.05 μg/kg，重現(xiàn)性好，回收率高，在1 μg/kg的添加水平下，回收率可達(dá)107%～113%。

    酶聯(lián)免疫法的缺點在于影響因素較多，易出現(xiàn)大量假陽性結(jié)果?？贵w批次不同，測定結(jié)果也會出現(xiàn)差異。

1.3　CHARM II

    CHARM II檢測氯霉素殘留試劑盒為美國FDA推薦使用的檢測儀器，是由美國CHARM Science公司研制生產(chǎn)的第二代產(chǎn)品。CHARM公司是一家運用現(xiàn)代生物技術(shù)研制快速檢測方法的跨國公司，生產(chǎn)的抗生素測試儀現(xiàn)被6個美國FDA實驗室、55個州立實驗室和7個美軍基地作為標(biāo)準(zhǔn)儀器使用；同時美國AOAC也采用CHARM II作為標(biāo)準(zhǔn)檢測工具。美國要求用快速檢測方法檢測后要驗證確認(rèn)，如用CHARM II法則不須驗證，但需要多個實驗室的檢測評價。

    此法的基本原理是：將免疫抗體溶于水后，加入含氯霉素的樣品中，在一定的孵育溫度下，樣品中的氯霉素與受體位點結(jié)合，再加入[3H]標(biāo)記的氯霉素抗原與多余的受體位點結(jié)合，孵育一段時間后離心沉淀，取沉淀物加閃爍液，用閃爍計數(shù)儀（CHARM II分析儀）測定熒光強度，樣品中氯霉素殘留量與熒光強度成反比。對于魚組織中氯霉素殘留量的檢出限可達(dá)0.15 μg/kg，但同樣存在假陽性結(jié)果的問題。

2　定量確認(rèn)方法

2.1　高效液相色譜法

    高效液相色譜法檢測氯霉素是一種靈敏度較高、可靠性較強的一種方法，此法重復(fù)性好、假陽性少，可以進(jìn)行定量鑒定，但檢出限較高，為5～10 μg/kg，回收率偏低。因為動物體內(nèi)成分復(fù)雜，一些雜質(zhì)干擾測定，應(yīng)用該法檢測時，對于樣品預(yù)處理必須仔細(xì)謹(jǐn)慎，以提高測定準(zhǔn)確性和靈敏度。

    Keukens等（1986）報道了用高效液相色譜法篩選和確證在可食用的動物組織中的氯霉素殘留。篩選方法是將試樣用蒸餾水提取，提取液通過Extrelut柱（Merck 11737），二氯甲烷洗脫，氮氣吹干，用水溶解殘留物并與甲苯分配，水相用于色譜分析。檢出限為5 μg/kg，添加水平為10 μg/kg時的回收率為58%。確證方法：用乙酸鈉緩沖液提取，加入葡糖苷酸酶和芳基磺酸酶于37 ℃孵育16 h，再加入200 mL乙酸乙酯和20 g氯化鉀，將有機相濃縮后溶于二氯甲烷-石油醚（1﹕1），通過硅膠Sep-Pak柱，用石油醚以及乙酸乙酯-正己烷（1﹕1）洗滌層析柱，然后用乙酸乙酯-正己烷（7﹕3）洗脫，將洗脫液濃縮后溶于Tris緩沖液（pH 10.4），乙醚萃取氯霉素，濃縮后溶于水和甲苯，水相用于色譜分析。該方法能確證10 μg/kg以上的氯霉素殘留，回收率為85%。

    Nagata等（1992）報道了用液相色譜法同時測定動物肌肉和養(yǎng)殖魚肌肉中的甲砜氯霉素和氯霉素殘留方法。試樣用乙酸乙酯提取，提取液濃縮至干，將殘留物溶于3%氯化鈉溶液，正己烷脫脂，水相用乙酸乙酯萃取，濃縮干乙酸乙酯后用正己烷溶解，過Sep-Pak Florisil柱凈化后，用ODS柱分離，225 nm或270 nm檢測，當(dāng)氯霉素為0.1 μg /g時平均回收率大于74.1%，檢出限量為10 μg/kg。

    比利時的Degroodt J.M.（1992）用HPLC及碘斯特光陣研究檢測了魚中氯霉素和硝基呋喃的殘留。氯霉素用乙酸乙酯提取，提取液經(jīng)石油醚和n-戊烷純化，然后用HPLC及光陣檢測器（Photodiode array detector）于280 nm處檢測。樣品回收率在69%～88％之間，研究表明，檢出限可達(dá)2 μg/kg。

    王秉棟（1991）報道了動物性食品中氯霉素殘留測定的高效液相色譜法。試樣處理：將試樣用一定量的無水硫酸鈉研成干粉狀，加1 mol/L乙酸鈉緩沖液20 ml、乙酸乙酯10 ml，振蕩提取，過濾，殘渣用乙酸鈉緩沖液洗滌，并入提取液，分出有機層，水相用乙酸乙酯萃取兩次，提取液再用飽和氯化鈉洗滌兩次，乙酸乙酯濃縮后，用10 ml 20%乙腈水溶液溶解，再用20 ml石油醚脫脂，水層用于分析。色譜條件：Hypersil H5 ODS柱，10 cm×4 mm，流動相為水-乙腈-1 mol/L乙酸鈉緩沖液（80﹕20﹕1），檢測波長280 nm。

    李蘭生（1997）等用高效液相色譜法檢測了對蝦體內(nèi)氯霉素的殘留量，并進(jìn)行了氯霉素在對蝦體內(nèi)的動力學(xué)研究。試樣制備：對蝦組織中加入與試樣等量的蒸餾水，勻漿，加入4倍量甲醇，振搖提取，離心后上清液分析。分離條件：μ-Bondapak C18柱，流動相為甲醇-水（30﹕70），在氯霉素添加濃度為2.5 mg/kg時的回收率為91.2%。

2.2　氣相色譜法

    氣相色譜法的特點是高分離效能、高選擇性、高靈敏度、快速，應(yīng)用廣，還可用于制備高純物質(zhì)。它可以對于分配系數(shù)相差很近的組分進(jìn)行分離，從而分離出極為復(fù)雜的混合物。檢出限低，有許多高靈敏、通用性或?qū)Ｒ恍詮姷臋z測器供選用，如氫焰離子化檢測器（FID）、電子捕獲檢測器（ECD）、氮磷檢測器（NPD）等，檢出限一般為μg/kg級，常用于抗生素藥物殘留的檢測。但是大多數(shù)獸藥極性或沸點偏高，需繁瑣的衍生化步聚，因而限制了GC的應(yīng)用（李俊鎖 1997）。

    氣相色譜檢測法中較為靈敏的方法是1974年10月AOAC年會上由Jacobson等人提出的（Jacobson 1974）。該方法用乙酸乙酯提取動物組織中的藥物，用含4% NaCl溶液的正己烷去除脂類物質(zhì)，通過硅藻土色譜柱提純凈化，加入四甲基硅烷（TMS）衍生化，最后進(jìn)樣檢測。肌肉樣品的回收率大于80%，檢出限低于1 μg/kg。色譜條件：電子捕獲檢測器（ECD），Gas-Chrom Q色譜柱（含有4% Se-30），流動相為氬-甲醇（95﹕5）。

    王建華（2001）研究報道了同時測定魚肉中氯霉素和甲砜霉素殘留量的毛細(xì)管氣相色譜法。樣品中待測物用乙酸乙酯提取，濃縮至干，溶于水，用正己烷脫脂，水層過Sep-C18小柱凈化，甲醇洗脫后，用BSTFA-TMCS衍生，加入甲苯并用水滅活衍生過程，用帶有63Ni電子捕獲檢測器的氣相色譜儀檢測，外標(biāo)法定量。當(dāng)添加水平為5～20 μg/kg時，回收率為80％～108％。相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.5％～11％，線性相關(guān)系數(shù)r>0.997。

2.3　其它分析方法

    超臨界流體色譜（SFC）可彌補GC和HPLC的不足，但不可能取代二者。SFC優(yōu)點是可以方便地連接各種靈敏的檢測器（MS，ECD等）。

    毛細(xì)管區(qū)域電泳（CZE）兼有高壓電泳的高速、高分辨率和HPLC靈活、高效的優(yōu)點，可簡化樣品前處理、多殘留分析以及使分析自動化。目前，CZE的主要問題是樣品量太少，限制了檢測的靈敏度，CZE-MS可能是較好的解決辦法（李俊鎖 1997）。

3　聯(lián)用技術(shù)

    各種分析技術(shù)聯(lián)用是現(xiàn)代獸藥殘留分析乃至整個分析化學(xué)方法上的發(fā)展特點。計算機的應(yīng)用加速了這一趨勢。聯(lián)用技術(shù)可揚長避短,一般兼分離、定量和定性（分子結(jié)構(gòu)信息）于一體，因而特別適用于確證性分析。常見的聯(lián)用技術(shù)，有TLC-MS、LC-MS、GC-MS、SFC-MS、CZE-MS、LC-NMR等。

    TLC-MS是較簡單的離線聯(lián)用技術(shù)。LC-MS現(xiàn)在已進(jìn)入實用階段，其靈敏度較熒光檢測器高1個數(shù)量級，能方便地對ng/kg級的獸藥殘留組分進(jìn)行檢測與結(jié)構(gòu)確證，是美國FDA推薦使用的氯霉素確證方法。GC-MS已相當(dāng)成熟，主要采用電子轟擊源（EI）和負(fù)離子化學(xué)源（NCI），EI源的氣質(zhì)聯(lián)用法的檢出限一般高于5 μg/kg，NCI源的氣質(zhì)聯(lián)用法靈敏度高，檢出限可達(dá)到0.1 μg/kg，但NCI源的氣質(zhì)聯(lián)用儀的普及性較差。

    Tomoko Nagata等（1996）報道了用GC-MS法檢測黃尾魚肌肉中的氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素的殘留。該方法采用了對3種藥物具有相似響應(yīng)因子的電子捕獲檢測器（ECD），使得3種藥物能在低濃度時同時檢測到。用乙酸乙酯提取藥物，并將提取液蒸干，殘存物溶于NaCl溶液中，加適量正己烷去除脂類物質(zhì)，然后再用乙酸乙酯提取藥物，蒸干后將殘留物用正己烷溶液和乙醚溶解，用Sep-Pak到Florisil柱提純凈化，提取物在50 ℃條件下經(jīng)衍生化后，用氣譜-質(zhì)譜聯(lián)用機檢測。藥物由包被有5%苯基甲基硅的毛細(xì)管柱分離，回收率大于65%，檢出限為5 μg/kg。

    總的說來，基于抗原抗體特異性反應(yīng)建立起來的免疫學(xué)測定方法靈敏度較高，特異性強，試樣預(yù)處理簡單，分析時間短，現(xiàn)在已出現(xiàn)一些試劑盒產(chǎn)品，使用方便，因此，在現(xiàn)場監(jiān)控和基層的大規(guī)模篩選檢測中，免疫學(xué)檢測方法更實際，有廣闊的應(yīng)用前景。

    國際上公認(rèn)的定量確認(rèn)方法仍是理化分析法，主要是氣相色譜法和液相色譜法，這兩種方法靈敏度高，結(jié)果準(zhǔn)確，重復(fù)性好，假陽性少，缺點是樣品前處理過程復(fù)雜、儀器化程度高且價格昂貴，分析速度慢。二者相比較，由于HPLC檢出限較高，已逐漸不能滿足發(fā)達(dá)國家對檢測方法檢出限的要求。聯(lián)用技術(shù)出現(xiàn)后，LC-MS由于靈敏度高，檢出限更低，結(jié)果精確可靠，在氯霉素殘留的分析中正逐漸代替單一的色譜技術(shù)。

    國家水產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心目前在氯霉素殘留檢測工作中，采用酶聯(lián)免疫法對樣品進(jìn)行初期篩選，用配有ECD的氣相色譜儀及GC-MS聯(lián)用技術(shù)進(jìn)行確認(rèn)及定量分析，檢出限可以達(dá)到1 μg/kg，完全能夠滿足目前檢測工作的需要。并且即將采用LC-MS技術(shù)，可使檢出限水平達(dá)到0.1 μg/kg，與國際當(dāng)前先進(jìn)水平接軌。

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